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　　工學(xué)院陳匡時(shí)課題組在活細(xì)胞單分子成像DNA技術(shù)領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展

　　最近，工學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系陳匡時(shí)課題組基于分子信標(biāo)(MB)與CRISPR/dCas9 系統(tǒng)成功研制出一種名為CRISPR/dual-FRET MB的新型活細(xì)胞基因成像技術(shù)。該研究成果已發(fā)表于Nucleic Acids Research(《核酸研究》)(IF = 11.147)，題目為 “CRISPR/dual-FRET molecular beacon for sensitive live-cell imaging of non-repetitive genomic loci”。

　　目前，在活細(xì)胞中成像基因組主要借助熒光蛋白實(shí)現(xiàn)。但是熒光蛋白具有亮度低、光穩(wěn)定性低等缺點(diǎn)，需要給標(biāo)記單一基因組位點(diǎn)標(biāo)記多個(gè)熒光蛋白才可實(shí)現(xiàn)成像。然而，過(guò)度的熒光標(biāo)記可能會(huì)對(duì)基因組位點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)造成影響，因此，目前熒光蛋白方法在成像單基因組位點(diǎn)上的能力有限。許多研究已經(jīng)表明，有機(jī)染料具有比熒光蛋白更高的信號(hào)強(qiáng)度與光穩(wěn)定性，因此，基于有機(jī)染料的標(biāo)記方法有望提高對(duì)單基因組位點(diǎn)的成像能力。

　　陳匡時(shí)課題組在先前的研究中已經(jīng)證實(shí)有機(jī)染料在活細(xì)胞中標(biāo)記基因組位點(diǎn)的可行性。 所采取的手段是將CRISPR sgRNA進(jìn)行改造，使其能夠與一種名為分子信標(biāo)(MB)的寡核苷酸探針互補(bǔ)(CRISPR/MB: Wu X. et al, Nucleic Acids Res. 2018; 46, e80)。由于sgRNA具有高度可改造性，陳匡時(shí)課題組最新的工作進(jìn)一步改造了sgRNA，使其能夠與一對(duì)可發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET) 的MB互補(bǔ), 構(gòu)建出CRISPR/dual-FRET MB (圖1)。由于只有當(dāng)兩個(gè)MB 同時(shí)互補(bǔ)于同一個(gè)sgRNA時(shí)FRET信號(hào)才能產(chǎn)生，該方法能夠更好地區(qū)分來(lái)自基因組位點(diǎn)的信號(hào)與游離MB所造成的背景。實(shí)驗(yàn)證明，CRISPR/dual-FRET MB通過(guò)三個(gè)sgRNA即可在普通寬場(chǎng)顯微鏡下成像單基因組位點(diǎn)(圖2A)，并且能區(qū)分不同基因組位點(diǎn)(MUC4, MUC1, IGR)的運(yùn)動(dòng)(圖2B)。值得一提的是，CRISPR/dual-FRET MB 是首個(gè)被報(bào)道的、僅需3個(gè)sgRNA 就能在寬場(chǎng)顯微鏡下成像單基因組位點(diǎn)(非重復(fù)序列)的技術(shù)。此外， CRISPR/dual-FRET MB的分子量比現(xiàn)有最靈敏的CRISPR 標(biāo)記技術(shù)(基于熒光蛋白)小6倍以上，因此可能對(duì)被標(biāo)記位點(diǎn)的生物學(xué)功能造成較小的影響。CRISPR/dual-FRET MB的應(yīng)用有望幫助研究者對(duì)染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行更深入細(xì)致的闡述。

　　該工作的第一作者是毛詩(shī)琦。應(yīng)亞宸、吳小天和Christopher Krueger(PKU/GT/Emory聯(lián)合培養(yǎng)項(xiàng)目博士生)為工作的順利完成做出重要貢獻(xiàn)。通訊作者為陳匡時(shí)特聘研究員。此項(xiàng)工作得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃和國(guó)家自然科學(xué)基金的支持。

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