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　　工學院陳匡時課題組在基于CRISPR的單分子成像DNA技術領域取得新進展

　　最近，工學院生物醫(yī)學工程系陳匡時">陳匡時課題組基于CRISPR基因編輯技術與分子信標 (MB) 研制出一種名為CRISPR/MB的新型單基因位點成像技術。該研究成果已發(fā)表于Nucleic Acids Research (《核酸研究》) (IF = 10.162)，題目為“A CRISPR/Molecular Beacon Hybrid System for Live-Cell Genomic Imaging”。

　　CRISPR基因編輯技術是一種能夠有效且穩(wěn)定地將目的基因敲除的方法。該技術是由Cas9 蛋白與single-guide RNA (sgRNA) 組成。Cas9 是一種DNA 內切酶，sgRNA則同時具有能和特定基因組序列互補的位點(spacer 序列) 以及和Cas9 結合的結構域。因此，Cas9在與sgRNA 形成復合體后能通過spacer 序列靶向特定基因位點并將其破壞，從而達到定點編輯基因組的目的。前人的研究發(fā)現，失去酶切活性的Cas9 (nuclease-deactivated Cas9, dCas9) 也能夠通過結合sgRNA 靶向特定基因組，由此開創(chuàng)了使用dCas9與sgRNA 成像特定基因組的研究領域。

　　目前，基于CRISPR技術在活細胞中標記基因組的方法主要通過將熒光蛋白連接于dCas9 或sgRNA上實現成像。但是熒光蛋白具有亮度低、易被光漂白以及不能被淬滅等缺點，在單分子成像單基因位點上能力有限。本研究所使用的分子信標 (MB)則是一種基于化學熒光基團、具有可淬滅特性的寡核苷酸探針 (圖一)，其兩端分別連有一個化學熒光基團和一個淬滅基團，在不與目的RNA結合時MB通過自身形成莖環(huán)結構呈現出低熒光狀態(tài)，而在與目的RNA互補后莖結構解離進入高熒光狀態(tài)，MB因其獨特的成像優(yōu)勢成為目前活細胞標記內源RNA的主要手段之一。通過改造sgRNA 的結構，陳匡時">陳匡時實驗室巧妙地將MB與CRISPR技術結合起來，成功研制出帶有MB靶序列(MTS)的sgRNA (SL2-sgRNA-MTS)，并證實 dCas9 和SL2-sgRNA-MTS 能形成穩(wěn)定的復合體，并與特定的單基因位點結合。MB進入細胞后能與復合體中的MTS 互補，使得該基因位點被熒光標記。熒光成像顯示，被標記后的單基因位點在傳統熒光顯微鏡下呈現單一亮點 (圖二)。CRISPR/MB的研發(fā)與應用有望幫助研究者對目的基因組在細胞核的轉運與定位，及其與疾病的發(fā)生發(fā)展的關系等科學問題進行更深入的闡述。

　　該工作的第一作者是吳小天。毛詩琦、楊艷濤等學生為工作的順利完成做出重要貢獻。通訊作者為工學院陳匡時">陳匡時特聘研究員。該工作得到了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金、北京市自然科學基金的支持。

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